高通量測序（high-throughput sequencing, HTS）即下一代測序（next generation sequencing, NGS），又稱為大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing, MPS）。相較于傳統(tǒng)測序技術(shù)，高通量測序單堿基檢測成本較低、速度較快、一次可檢測大量靶基因，因而廣泛應(yīng)用于染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、腫瘤靶向治療基因突變檢測、遺傳性腫瘤檢測、遺傳病及罕見病檢測、病原微生物及宏基因組檢測、胚胎植入前遺傳學篩查和胚胎植入前遺傳學診斷等領(lǐng)域。
由北京市臨床檢驗中心、北京醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會、首都醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學系、北京市醫(yī)學檢驗質(zhì)量控制和改進中心牽頭起草的于2019年11月19日在《中華醫(yī)學雜志》刊出的《高通量測序技術(shù)臨床檢驗規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版通用部分）》【1】之后，又一篇專門針對遺傳病的《高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版遺傳病部分）》【2】于2020年3月10日正式見刊于《中華醫(yī)學雜志》。該共識闡述了高通量測序在遺傳病領(lǐng)域臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用的基本原則，應(yīng)用NGS技術(shù)進行遺傳變異檢測的實驗室可按照本共識進行實驗室的總體設(shè)計、檢測方法的設(shè)計和性能確認、遺傳變異解讀及結(jié)果報告、質(zhì)量保證和遺傳咨詢，最大可能地為臨床提供準確可靠的遺傳變異檢測結(jié)果。該共識對于今后高通量測序應(yīng)用于遺傳病的臨床檢測具有較高的指導(dǎo)意義。
安塞斯醫(yī)學部馬懿老師、生信部曹彥東老師受邀積極參與了該共識的執(zhí)筆撰寫工作。安塞斯作為行業(yè)內(nèi)的高新技術(shù)企業(yè)受邀參與此次共識撰寫，表明了業(yè)界對安塞斯檢測、質(zhì)控能力、數(shù)據(jù)解讀及遺傳咨詢能力的高度肯定和權(quán)威認可。
該共識重點強調(diào)了基于通用共識的基礎(chǔ)、更適應(yīng)于遺傳病特點的高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用特點，而對于與通用共識一致的部分不再予以贅述。最后，需注意的是在臨床應(yīng)用中，NGS檢測結(jié)果還應(yīng)充分結(jié)合家族史、疾病表型和其他輔助檢查結(jié)果，綜合評估后做出臨床決策。另外，鑒于NGS技術(shù)在遺傳病臨床應(yīng)用領(lǐng)域的迅速發(fā)展，該共識將適時修訂，以適應(yīng)臨床規(guī)范化應(yīng)用的需求【2】。
共識主要內(nèi)容包括：
共識1
開展遺傳病NGS檢測的實驗室應(yīng)根據(jù)其所采用的測序平臺、建庫技術(shù)流程以及是否有多項目檢測進行適當?shù)膶嶒炇曳謪^(qū)設(shè)計，如實驗室同時進行腫瘤體細胞突變NGS檢測，則“濕實驗”的核酸提取及建庫過程相關(guān)區(qū)域不宜與之混用。應(yīng)配備“濕實驗”和“干實驗”流程研發(fā)、變異解讀和遺傳咨詢?nèi)藛T，生物信息學分析人員應(yīng)為一個具有醫(yī)學或遺傳學背景的團隊，負責建立生物信息分析流程并對其進行性能確認，以及與IT人員一起合作建立相關(guān)疾病變異和表型實驗室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫;變異解讀人員應(yīng)具有醫(yī)學、遺傳學和分子生物學專業(yè)知識，并能在臨床背景下對遺傳變異結(jié)果給予相應(yīng)解釋;遺傳咨詢?nèi)藛T應(yīng)具有醫(yī)學背景和遺傳學知識，熟悉相關(guān)領(lǐng)域遺傳咨詢的概念和方法。實驗室負責人應(yīng)清晰了解所開展的遺傳變異NGS檢測項目及其質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)。所有人員均應(yīng)隨相應(yīng)研究進展及時更新知識。
共識2
遺傳病NGS檢測實驗室所開展的檢測項目臨床預(yù)期用途通常應(yīng)為先證者確認診斷、懷疑患有遺傳病的患者的輔助診斷、宮內(nèi)胎兒表型提示遺傳病但染色體核型分析未發(fā)現(xiàn)異常的產(chǎn)前診斷、或育齡夫婦的孕前遺傳病攜帶者篩查(一般限于早發(fā)的嚴重致殘致死的人群攜帶率較高的隱性遺傳病)等，實驗室應(yīng)根據(jù)預(yù)設(shè)的上述臨床預(yù)期用途選擇合適的NGS檢測方法，如靶向測序、WES和WGS等。
共識3
開展遺傳病NGS檢測的實驗室應(yīng)根據(jù)預(yù)設(shè)的臨床預(yù)期用途決定將哪些基因納入擬檢測的靶基因，當預(yù)期用途為諸如產(chǎn)前診斷和攜帶者篩查的預(yù)測性檢測時，則只能納入與疾病有明確相關(guān)性的基因。可采用ClinGen發(fā)布的基因臨床有效性管理標準操作程序，利用遺傳學和實驗證據(jù)評估基因的臨床有效性，并定期對證據(jù)進行系統(tǒng)性回顧，以尋找是否出現(xiàn)新的證據(jù)支持。如直接采用WES檢測，則需要盡可能覆蓋已知疾病相關(guān)基因的所有外顯子。目前不同來源的WES捕獲試劑，其對外顯子區(qū)域的捕獲能力有所不同，實驗室需清楚這些差異并在性能確認中明確捕獲效率和覆蓋度。WGS在遺傳病的基因檢測中亦應(yīng)用越來越廣，但其仍存在檢測成本高、不能準確測序所有區(qū)域及結(jié)果解釋與報告難等局限性。因此，實驗室應(yīng)預(yù)先建立基因的臨床有效性和已知基因突變譜臨床檢測應(yīng)用的一般原則，以便在WES或WGS檢測結(jié)果解讀與報告時使用。
共識4
基于NGS的遺傳病檢測方法，在臨床應(yīng)用之前，需要經(jīng)過完整的分析性能確認和必要的臨床性能確認，從而確立檢測的分析和臨床性能指標，并最終建立整個流程的SOPs。遺傳病NGS檢測性能確認是基于方法學的性能確認?！案蓪嶒灐毙阅艽_認需使用已知變異的臨床樣本測序數(shù)據(jù)，并可使用參考標準品數(shù)據(jù)集和電子模擬數(shù)據(jù)集作為補充，通過性能確認分析針對不同變異類型的檢測敏感性、特異性和重復(fù)性。分析性能指標包括精密度、準確度、可報告范圍和參考區(qū)間、分析敏感性和分析特異性等，嵌合體異常細胞比例或線粒體DNA異質(zhì)性比例檢測還需確定LOD。臨床有效性和臨床有用性性能指標包括臨床敏感性、臨床特異性、特定人群的陽性和陰性預(yù)測值(適用時)等。實驗室應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途建立不同樣本類型和不同變異類型的分析性能指標。WES或者WGS檢測性能確認中需納入不同遺傳模式樣本及家系樣本。實驗室應(yīng)在確認過程中建立整個流程各步驟的質(zhì)量控制指標及參數(shù)。還應(yīng)建立當檢測和分析流程發(fā)生改變時進行再次確認的程序及再次確認時應(yīng)滿足的性能。
共識5
開展遺傳病NGS檢測的實驗室應(yīng)確定在NGS檢測到的陽性結(jié)果用于疾病臨床診斷和管理之前，是否需要使用其他方法如Sanger測序等對其進行確認，并且在何種情況下需對其他家庭成員進行進一步確認。實驗室也可建立不需要進行驗證的變異類型(如SNVs)需要滿足的性能參數(shù)和質(zhì)量參數(shù)閾值。但是對于具有檢測技術(shù)難度的變異類型(如indels等)是否需要進一步確認檢測仍需慎重考慮。此外，目前通過NGS檢測CNVs的準確性仍存在一些問題，尤其是對于基因內(nèi)外顯子水平的缺失和重復(fù)，因此，對NGS檢出的CNVs應(yīng)進行驗證確認。
共識6
開展遺傳病NGS檢測的實驗室需基于ACMG指南對遺傳變異進行五級分類解讀，并在正確理解指南各條款的情況下，結(jié)合本實驗室具體情況建立解讀流程并制訂可操作性SOPs，保證本實驗室變異解讀的重復(fù)性和再現(xiàn)性，變異命名應(yīng)遵循HGVS或ISCN規(guī)則，結(jié)果報告中應(yīng)包含必要的信息，清楚描述所使用的技術(shù)方法及其局限性，并且報告中需有針對檢測結(jié)果的遺傳咨詢建議，詳細描述支持變異解讀的相關(guān)證據(jù)，并說明檢測到的變異是否能夠充分或者部分解釋患者的臨床表型。對于致病性明確但與檢測目的無關(guān)的非預(yù)期變異，隱性疾病的攜帶狀態(tài)及尚無相關(guān)臨床表現(xiàn)的意外發(fā)現(xiàn)是否需要報告及如何報告，實驗室應(yīng)有相應(yīng)的報告和確認原則，如需報告，應(yīng)在患者和親屬簽署相關(guān)知情同意后進行。實驗室需預(yù)先確定trio檢測報告原則并充分做好知情同意。實驗室應(yīng)結(jié)合實際情況制訂是否因臨床需求對遺傳數(shù)據(jù)進行再分析及如何進行再分析和提供修正報告的相應(yīng)原則?，F(xiàn)階段的檢測報告應(yīng)由具備相關(guān)資質(zhì)的醫(yī)生或授權(quán)簽字人審核后簽發(fā)。
共識7
開展遺傳病NGS檢測的實驗室應(yīng)建立本實驗室質(zhì)量保證計劃，涵蓋分析前、分析中和分析后各環(huán)節(jié)，預(yù)先設(shè)定每個樣本或每批次檢測各步驟質(zhì)量控制關(guān)鍵核查點和相關(guān)質(zhì)量控制參數(shù)，并明確規(guī)定可接受和拒絕的標準，同時預(yù)先設(shè)定需要持續(xù)監(jiān)測的質(zhì)量指標，根據(jù)其變化趨勢決定是否需要對流程進行進一步優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)問題后采取糾正措施，必要時采取預(yù)防措施，并記錄其對檢測質(zhì)量持續(xù)改進的影響。實驗室應(yīng)定期參加國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心組織的相關(guān)EQA/PT計劃，尚無EQA/PT計劃的檢測項目，可定期與外部實驗室交換樣本進行比對或盲樣檢測本實驗室之前檢測過的樣本。對整個檢測流程的記錄是實驗室質(zhì)量保證的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
共識8
基于NGS方法的遺傳檢測項目應(yīng)由具備相關(guān)專業(yè)背景和資質(zhì)的遺傳咨詢師或臨床醫(yī)生在檢測前和檢測后對患者及其家屬進行遺傳咨詢，咨詢應(yīng)在以倫理和道德為中心、咨詢對象自愿、完全知情和保護隱私等基本原則下進行。進行遺傳咨詢時需包含一般的遺傳咨詢，同時考慮NGS檢測的特殊性。另外針對不同的檢測目的，如攜帶者篩查、遺傳病診斷和產(chǎn)前診斷，還要有側(cè)重性的遺傳咨詢。
《高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版遺傳病部分）》【2】涵蓋了包括國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心、北京市臨床檢驗中心、北京大學人民醫(yī)院、北京大學第一醫(yī)院、中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院、首都兒科研究所、中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心、國家兒童醫(yī)學中心、北京市海淀區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心、中國科學院計算技術(shù)研究所、中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所，以及基因檢測行業(yè)內(nèi)頂級公司的多位專家， 高通量測序技術(shù)是分子檢測領(lǐng)域又一個劃時代的進步，該技術(shù)在生命科學和醫(yī)學各個領(lǐng)域均產(chǎn)生了深遠的影響，尤其推動了遺傳學、腫瘤學和生殖生育等學科的發(fā)展。
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北京安智因生物技術(shù)有限公司成立于2017年。是一家致力于應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)，為臨床醫(yī)學服務(wù)提供整體解決方案的創(chuàng)新型企業(yè)。
旗下設(shè)有安塞斯（北京）生物技術(shù)有限公司，北京安智因醫(yī)學檢驗實驗室有限公司、蘇州安智因醫(yī)學檢驗所。研發(fā)中心擁有世界一流的分子生物學硬件與生物信息分析能力。
主營業(yè)務(wù)：心血管病、腎病、血液病等體外診斷試劑盒的研發(fā)與轉(zhuǎn)化，以及遺傳病分子診斷、個體化用藥指導(dǎo)檢測與腫瘤分子檢測等多項臨床檢測服務(wù)。安智因在全國10余個主要城市設(shè)立了與醫(yī)院共建的LDT聯(lián)合實驗室和獨立醫(yī)學檢驗所。
核心團隊由國內(nèi)外頂級醫(yī)院及研究機構(gòu)的專家組成，在心血管病、血液病等領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗。
參考文獻
【1】 北京市臨床檢驗中心等. 高通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版通用部分）.中華醫(yī)學雜志.2019,99(43):3393-3397.
【2】北京市臨床檢驗中心等. 高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版遺傳病部分）. 中華醫(yī)學雜志.2020,100(9):660-668.
