隨著個體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展和“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念的提出，腫瘤藥物治療發(fā)展迅速，臨床研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實更多與藥物治療療效預(yù)測相關(guān)的基因突變。高通量測序技術(shù)因其在通量、成本和效率方面的優(yōu)勢，已在實體腫瘤體細(xì)胞基因突變中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。然而，實體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測中，低頻突變、腫瘤異質(zhì)性、樣本種類多樣、樣本質(zhì)量差別較大等均給實驗室檢測帶來了挑戰(zhàn)，因此其在方法建立、分析前、中、后質(zhì)量控制等方面均有其特殊之處。

《高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版腫瘤部分）》包括實驗室建設(shè)的總體要求和檢測流程的建立與質(zhì)量保證兩大部分，共達(dá)成8點專家共識，覆蓋體細(xì)胞基因突變NGS檢測實驗室分區(qū)、實驗室人員及能力要求，以及檢測項目的臨床預(yù)期用途確定、NGS方法學(xué)建立與優(yōu)化、LDTs性能確認(rèn)、實驗室檢測SOPs的建立即分析前中后的質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對進(jìn)一步規(guī)范化開展腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測的臨床應(yīng)用，提高檢測的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性，幫助臨床診療具有重大意義。

實體腫瘤體細(xì)胞突變檢測通常分析敏感性較高，臨床實驗室應(yīng)尤其注意合理分區(qū)，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區(qū)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備前區(qū)、樣本制備區(qū)、打斷區(qū)、電泳區(qū)、文庫制備區(qū)、擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)和測序區(qū)。但是不同檢測流程，分區(qū)設(shè)置有所不同，臨床實驗室應(yīng)根據(jù)“通用共識”的“32字原則”來考慮實驗室分區(qū)設(shè)置。若實驗室同時檢測血漿和組織或細(xì)胞學(xué)兩類樣本，則需設(shè)置不同的樣本制備區(qū)及其后續(xù)的文庫制備過程中的相應(yīng)區(qū)域。

NGS實驗室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實驗室質(zhì)量管理知識。采用組織樣本進(jìn)行檢測的實驗室，“濕實驗”團(tuán)隊成員應(yīng)包括病理醫(yī)（技）師人員。生物信息學(xué)分析團(tuán)隊中應(yīng)有具備臨床腫瘤學(xué)和臨床分子檢測基本知識的人員。簽發(fā)報告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識背景，熟練使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫，掌握本領(lǐng)域的指南，了解相關(guān)研究的最新進(jìn)展。對于疑難病例或必要時，可由不同專業(yè)的專家組成的分子腫瘤專家組給出個體化治療方案。使用LDTs的實驗室，應(yīng)配備“濕實驗”和“干實驗”研發(fā)人員，其應(yīng)具有正確設(shè)定腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測臨床預(yù)期用途、建立檢測系統(tǒng)（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認(rèn)的能力。

實體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測的臨床預(yù)期用途為通過體細(xì)胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監(jiān)測。臨床實驗室應(yīng)在預(yù)期用途中包括但不限于適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點或突變類型和檢測的臨床意義等。在NGS方法學(xué)建立和優(yōu)化階段，實驗室需根據(jù)臨床預(yù)期用途，選擇具有臨床意義的待測基因位點；優(yōu)化核酸提取方法，所提取核酸的質(zhì)量應(yīng)滿足檢測要求；建立和優(yōu)化文庫制備方法；對測序平臺進(jìn)行性能確認(rèn)，建立測序平臺檢測不同突變類型的性能指標(biāo)；搭建和優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程，確定測序深度和陽性判斷值，并對生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行性能確認(rèn)。

使用NMPA 批準(zhǔn)的NGS試劑進(jìn)行檢測前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗證；LDTs試劑應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途進(jìn)行試劑方法的設(shè)計和優(yōu)化，至少要對體細(xì)胞基因突變的識別策略、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、靶向捕獲、高通量測序平臺、生物信息學(xué)分析、測序深度和陽性判斷值等環(huán)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)。在完成試劑方法的設(shè)計和優(yōu)化后，實驗室應(yīng)對LDTs檢測的全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)至少證明NGS對各種不同突變類型的檢測能力，證明對重要常見基因的檢測能力。如果臨床實驗室可接收多個樣本類型，那么對每種樣本類型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報告范圍等。在確認(rèn)分析性能特征可以滿足臨床預(yù)期用途后，最終完成建立“濕實驗”試劑配制和“干實驗”生物信息學(xué)分析流程SOPs。對預(yù)期用途為伴隨診斷的NGS檢測需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)。性能評價應(yīng)包含檢測范圍內(nèi)樣本類型和突變類型。通過性能評價，建立性能參數(shù)，明確檢測的局限性。若實驗室流程發(fā)生改動，需根據(jù)對檢測的影響進(jìn)行全面或部分性能確認(rèn)。

實驗室應(yīng)制定每一種類型樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。采用FFPE、胸腹水細(xì)胞沉淀或新鮮組織進(jìn)行NGS檢測前，需先評估樣本質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過程中，應(yīng)使用一次性耗材。血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA 稀釋游離DNA 或游離DNA 降解。分析前記錄的關(guān)鍵點為樣本接收、拒收和預(yù)處理的記錄。當(dāng)樣本質(zhì)量未達(dá)到SOPs要求時，可進(jìn)行讓步檢測，但應(yīng)建立對應(yīng)的異常情況處理程序。

實驗室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗證的結(jié)果，建立分析中檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識別質(zhì)量值、比對質(zhì)量值和在靶率等要求，這些要求也同時是分析中實驗記錄的關(guān)鍵點。若某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的檢測質(zhì)量控制參數(shù)不符合要求，則實驗室應(yīng)根據(jù)所建立的異常情況的處理程序進(jìn)行處理。此外，實驗室應(yīng)根據(jù)可檢測的樣本類型、突變類型、檢測下限等設(shè)置合適的包括所檢測的所有突變類型的弱陽性、陰性和無模板對照（如水樣本）質(zhì)控品，且與待檢樣本同批檢測。定期參加EQA/PT或進(jìn)行實驗室間比對等。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。

腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測結(jié)果報告應(yīng)對檢測方法進(jìn)行詳細(xì)說明。腫瘤體細(xì)胞基因突變可以分為臨床意義明確、有潛在臨床意義、臨床意義不明確和良性或可能良性突變四級，臨床證據(jù)等級有A、B、C和D級。實驗室需要建立分級和報告的SOPs，明確對體細(xì)胞基因突變進(jìn)行分級的流程和在日常檢測中報告哪一級或哪幾級突變位點。分級的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來源的指南、文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫，證據(jù)等級，分級結(jié)果等。

實驗室應(yīng)對體細(xì)胞基因突變藥物療效預(yù)測的臨床意義進(jìn)行解釋。實驗室應(yīng)制定結(jié)果解釋的SOPs，并遵循準(zhǔn)確、及時和充分的原則。在需要的情況下，臨床實驗室應(yīng)給出進(jìn)一步檢測的建議。由于樣本質(zhì)量或其他質(zhì)量要求未達(dá)到，但樣本有限的情況進(jìn)行的讓步檢測，也應(yīng)在報告中進(jìn)行說明。與腫瘤無關(guān)的意外發(fā)現(xiàn)因難以解釋，建議不在檢測報告中進(jìn)行呈現(xiàn)。在對如結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進(jìn)行NGS檢測時，需結(jié)合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，并建立遺傳咨詢流程。

NGS技術(shù)在腫瘤的精準(zhǔn)診療中具有重要作用，實驗室應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量管理，保證NGS檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性?！陡咄繙y序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版腫瘤部分）》對實體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測中的臨床預(yù)期用途確定、方法建立與優(yōu)化、LDTs性能確認(rèn)、分析前中后的質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了闡述。目前，實體腫瘤基因突變NGS突變檢測主要用于腫瘤靶向用藥指導(dǎo)及其耐藥監(jiān)測和免疫治療療效評估。

對于實體腫瘤胚系變異NGS檢測的相關(guān)內(nèi)容，可參考同期發(fā)布的《高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版遺傳病部分）》^［2］。

參考文獻(xiàn)

【1】北京市臨床檢驗中心等. 高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版腫瘤部分）. 中華醫(yī)學(xué)雜志.2020,100(9):648-659.

【2】北京市臨床檢驗中心等. 高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版遺傳病部分）. 中華醫(yī)學(xué)雜志.2020,100(9):660-668.

【3】北京市臨床檢驗中心等. 高通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版通用部分）.中華醫(yī)學(xué)雜志.2019,99(43):3393-3397.