拷貝數(shù)變異(CNVs)是大于50個(gè)堿基對(duì)的缺失、重復(fù)或插入，在人類基因組變異中占很大比例，對(duì)人的身體健康有很大影響。目前，基于芯片的檢測(cè)方法在臨床中廣泛應(yīng)用，但全基因組測(cè)序(WGS)有望同時(shí)檢測(cè)CNVs和更小的變異，因此，利用WGS數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的檢測(cè)CNVs在臨床檢測(cè)中至關(guān)重要。目前，基于WGS數(shù)據(jù)檢測(cè)CNV的算法原理大致分為：paired-end reads, split reads和coverage depth，文章通過4種基于不同算法原理的CNV檢測(cè)軟件（Manta, Delly, ERDS, CNVnator）和一個(gè)基因分型工具(SV2)結(jié)合，得到可靠的CNVs結(jié)果。

文章從24例肢體畸形患者中隨機(jī)抽取10例作為訓(xùn)練組。對(duì)10例樣本進(jìn)行aCGH檢測(cè)CNV并通過IGV確認(rèn)，同時(shí)基于~30X WGS數(shù)據(jù)，選擇4個(gè)效果較好的CNV鑒定工具（Manta, Delly, ERDS, CNVnator）進(jìn)行下一步的分析。通過不同軟件的組合與過濾獲得最終檢測(cè)結(jié)果，確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并通過剩余的14例樣本進(jìn)行方案驗(yàn)證（圖 1）。

圖 1. 樣本選擇與分析流程

對(duì)于4種CNV檢測(cè)軟件，Delly與Manta的原理主要是基于paired-end檢測(cè)，CNVnator與ERDS的原理主要是基于coverage depth檢測(cè)，文章對(duì)CNV檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行過濾與合并：對(duì)于相同原理軟件的檢測(cè)結(jié)果，如果CNV區(qū)域存在75%的交集，檢測(cè)到不同類型的CNV則刪除結(jié)果，檢測(cè)到相同類型的CNV則合并結(jié)果；不同原理軟件之間的結(jié)果，交集的區(qū)域調(diào)整為50%；再通過SV2進(jìn)行基因分型，并對(duì)所有CNV結(jié)果進(jìn)行比較過濾（圖 2）。

圖 2. CNV結(jié)果分析流程

4種軟件的檢測(cè)結(jié)果差異較大。其中基于paired-end的軟件檢測(cè)到更多的CNV結(jié)果，尤其在50bp-1kb的缺失中差異明顯；CNVnator對(duì)1-50k范圍內(nèi)的檢測(cè)則更加敏感；相同檢測(cè)原理的軟件之間檢測(cè)結(jié)果一致性相對(duì)較高；Delly和CNVnator相比于Manta和ERDS軟件更加敏感，而Manta和ERDS的檢測(cè)結(jié)果在大約一半的病例中得到相互驗(yàn)證（圖 3）。

圖 3. 4種軟件的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)檢測(cè)結(jié)果隨機(jī)選擇1278個(gè)缺失和748個(gè)插入進(jìn)行IGV查看驗(yàn)證，軟件檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)的CNV區(qū)域重疊范圍為6.6%-89.5%之間，小的缺失型CNV比插入和大的缺失型CNV更易被檢出。ERDS和Manta軟件對(duì)1-50 kb缺失型CNV的檢測(cè)更準(zhǔn)確；Delly和CNVnator軟件對(duì)1 ~ 5 kb缺失型CNV的真陽性率達(dá)到50%以上；ERDS對(duì)大片段CNV檢測(cè)的敏感性最高；超過50kb的插入型CNV在基于coverage depth檢測(cè)的軟件中敏感性較高，但是此類CNV通過IGV查看時(shí)都沒有得到驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示，假陽性的CNV大多只由一種軟件檢出，多種軟件中共同檢出的結(jié)果基本可以確保真實(shí)性，而且大多真實(shí)的結(jié)果能夠通過genomAD數(shù)據(jù)庫得到驗(yàn)證（圖 4）。

圖 4. 不同軟件對(duì)不同類型CNV的檢測(cè)結(jié)果及IGV驗(yàn)證

通過366個(gè)真實(shí)的CNV（329個(gè)缺失，37個(gè)插入）和940個(gè)假陽性CNV（505個(gè)缺失，435個(gè)插入）對(duì)CNV過濾方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，根據(jù)4種軟件的結(jié)果對(duì)CNVs進(jìn)行過濾，對(duì)真實(shí)的靈敏度沒有影響，而且可以增加準(zhǔn)確性；SV2基因分型對(duì)缺失表現(xiàn)良好，但對(duì)插入的敏感性較低（圖 5）。

圖 5. 4種軟件結(jié)合與SV2過濾的CNV結(jié)果。

利用WGS數(shù)據(jù)檢測(cè)CNV可以解決aCGH中檢測(cè)區(qū)域局限、斷點(diǎn)不明確的問題，但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性不高，而使用高深度或長讀長測(cè)序的成本太高，不適用于臨床檢測(cè)。文章中使用多種CNV檢測(cè)工具進(jìn)行過濾的方法很好的解決了上述問題，4種檢測(cè)軟件依據(jù)不同的算法原理檢測(cè)CNV，結(jié)合不同軟件結(jié)果可以有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為WGS數(shù)據(jù)檢測(cè)CNV的臨床應(yīng)用開辟了新思路。

Coutelier, M., Holtgrewe, M., J?ger, M. et al. Combining callers improves the detection of copy number variants from whole-genome sequencing. Eur J Hum Genet (2021). https://doi.org/10.1038/s41431-021-00983-x.